Förderprojekt 2012

MikroRNA-9 als Modulator der ERG-Expression in der akuten myeloischen Leukämie

Autoren: Marius Bill, Heike Weidner, Sebastian Schwind, Universitätsklinikum Leipzig (aus dem Rundbrief 19, Oktober 2014).

Die Prognose der meisten Patienten mit einer akuten myeloischen Leukämie (AML) ist trotz intensiver Forschungsanstrengungen noch immer schlecht. Um zukünftig mit gezielten Therapien und patientenorientierten Behandlungsstrategien das Überleben dieser Patienten weiter verbessern zu können, ist ein tieferes Verständnis der AML-Pathogenese notwendig.

Mehrere Arbeitsgruppen konnten in den letzten Jahren einen Zusammenhang zwischen einer schlechteren Prognose und einer höheren Expression des Gens, das für den Transkriptionsfaktor ETS-related-gene (ERG) kodiert, in der AML nachweisen [1-5]. Kürzlich wurden Signalwege und Gene identifiziert, die durch diesen Transkriptionsfaktor beeinflusst werden und zur Krankheitsaggressivität beitragen [6].

In diesem Projekt führten wir zunächst gain-and-loss of function-Experimente durch, um zu validieren, dass eine differentielle ERG-Expression einen Einfluss auf die AML-Aggressivität hat und nicht lediglich ein bystander oder statistischer Surrogatmarker ist. Beispielhaft zeigen wir hier Proliferationsexperimente. Dafür wurde die ERG-Expression in einer AML-Ziellinie mit relativ niedriger endogener ERG-Expression (MV4-11) gesteigert, was in einer stärkeren Proliferation der AML-Zellen resultierte (Abb. 1A). Hingegen führte der siRNA-vermittelte ERG-knock-down in einer Zelllinie mit einer relativ hohen endogenen ERG-Expression (KG1a) zu einer verlangsamten Proliferation (Abb. 1B). Diese Experimente weisen darauf hin, dass die ERG-Expression eine relevante Komponente in der AML ist, die zu einer gesteigerten Blasten-Proliferation beiträgt.

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Abbildung 1: (A) Erhöhte Zellproliferation nach ERG-Überexpression in der MV4-11 Zelllinie mit niedriger endogener ERG Expression. (B) Erniedrigte Zellproliferation nach ERG-knock-down in der KG1a Zelllinie mit hoher endogener ERG Expression. (C) Eine miR-9 Überexpression führt zu einer niedrigeren Expression von ERG in KG1a Zellen auf mRNA-Ebene (D) und Protein Ebene. (E) Funktionell führt die Überexpression von miR-9 in KG1a Zellen zu einer Proliferationshemmung.

Die biologischen Ursachen, die zu einer differentiellen ERG-Expression beitragen, sind bisher noch relativ unerforscht. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass MikroRNAs (miRs) wichtige post-transkriptionale Regulatoren in der AML sind [7,8]. So konnten Coskun et al. mit miR-196a und miR-196b bereits zeigen, dass ERG durch miRs reguliert werden kann [9]. Deshalb eruierten wir als nächstes, welche miRs darüber hinaus zu einer differentiellen ERG-Expression führen und ob diese einen Einfluss auf die Biologie bzw. Aggressivität von AML-Zellen haben.

Über in silico Analysen konnten wir zunächst feststellen, dass in der 3′-untranslatierten Region (3′-UTR) von ERG drei putative Bindungsstellen für die miR-9 vorhanden sind. Interessanterweise konnte für diese miR bereits zum einen eine tumorsuppressive Funktion in pädiatrischer AML mit der Translokation t(8;21) beschrieben werden [10], zum anderen ist diese miR in NPM1 mutierten AML-Zellen hochreguliert [11]. Ausgehend von dieser Beobachtung untersuchten wir, ob die Expression der miR-9 Einfluss auf die des Transkriptionsfaktors ERG hat. Dazu wurden zunächst AML-Zellen (KG1a) transfiziert. Wir konnten so eine miR-9 abhängige Herunterregulierung von ERG sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene nachweisen (Abb. 1C und 1D). Darüber hinaus zeigte sich nach Überexpression der miR-9 eine deutlich langsamere Zellproliferation als in den Kontrollzellen (Abb. 1E), ähnlich dem beobachteten Effekt nach ERG-knock-down (Abb. 1B). Ein Luciferase-Assay zeigte, dass die Genexpression insbesondere durch die erste der Bindungsstellen beeinflusst wird. Diese Experimente weisen auf einen direkt modulierenden Effekt der miR-9 auf die ERG-Expression in der AML hin.

Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen im Rahmen dieses Projekts, dass der Transkriptionsfaktor ERG Einfluss auf den AML-Phänotyp hat und seine Expressionslevel durch miR-9 moduliert werden können. Ein pharmakologisches oder direktes Anheben der miR-9 Spiegel in AML-Blasten könnte zu einer Verbesserung der Prognose von AML-Patienten beitragen.

Referenzen und Quellen

  1. Haferlach C, Kern W, Schindela S, Kohlmann A, Alpermann T, Schnittger S, Haferlach T. Gene expression of BAALC, CDKN1B, ERG, and MN1 adds independent prognostic information to cytogenetics and molecular mutations in adult acute myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 2012;51(3):257-65. PMID: 22072540. doi: 10.1002/gcc.20950.
  2. Marcucci G, Maharry K, Whitman SP, Vukosavljevic T, Paschka P, Langer C, Mrozek K, Baldus CD, Carroll AJ, Powell BL, Kolitz JE, Larson RA, Bloomfield CD, Cancer, Leukemia Group BS. High expression levels of the ETS-related gene, ERG, predict adverse outcome and improve molecular risk-based classification of cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B Study. J Clin Oncol. 2007;25(22):3337-43. PMID: 17577018. doi: 10.1200/JCO.2007.10.8720.
  3. Metzeler KH, Dufour A, Benthaus T, Hummel M, Sauerland MC, Heinecke A, Berdel WE, Buchner T, Wormann B, Mansmann U, Braess J, Spiekermann K, Hiddemann W, Buske C, Bohlander SK. ERG expression is an independent prognostic factor and allows refined risk stratification in cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a comprehensive analysis of ERG, MN1, and BAALC transcript levels using oligonucleotide microarrays. J Clin Oncol. 2009;27(30):5031-8. PMID: 19752345. doi: 10.1200/JCO.2008.20.5328.
  4. Schwind S, Marcucci G, Maharry K, Radmacher MD, Mrozek K, Holland KB, Margeson D, Becker H, Whitman SP, Wu YZ, Metzeler KH, Powell BL, Kolitz JE, Carter TH, Moore JO, Baer MR, Carroll AJ, Caligiuri MA, Larson RA, Bloomfield CD. BAALC and ERG expression levels are associated with outcome and distinct gene and microRNA expression profiles in older patients with de novo cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B study. Blood. 2010;116(25):5660-9. PMID: 20841507. doi: 10.1182/blood-2010-06-290536.
  5. Thol F, Yun H, Sonntag AK, Damm F, Weissinger EM, Krauter J, Wagner K, Morgan M, Wichmann M, Gohring G, Bug G, Ottmann O, Hofmann WK, Schambach A, Schlegelberger B, Haferlach T, Bowen D, Mills K, Ganser A, Heuser M. Prognostic significance of combined MN1, ERG, BAALC, and EVI1 (MEBE) expression in patients with myelodysplastic syndromes. Ann Hematol. 2012;91(8):1221-33. PMID: 22488406. doi: 10.1007/s00277-012-1457-7.
  6. Goldberg L, Tijssen MR, Birger Y, Hannah RL, Kinston SJ, Schutte J, Beck D, Knezevic K, Schiby G, Jacob-Hirsch J, Biran A, Kloog Y, Marcucci G, Bloomfield CD, Aplan PD, Pimanda JE, Gottgens B, Izraeli S. Genome-scale expression and transcription factor binding profiles reveal therapeutic targets in transgenic ERG myeloid leukemia. Blood. 2013;122(15):2694-703. PMID: 23974202. doi: 10.1182/blood-2013-01-477133.
  7. Garzon R, Volinia S, Liu CG, Fernandez-Cymering C, Palumbo T, Pichiorri F, Fabbri M, Coombes K, Alder H, Nakamura T, Flomenberg N, Marcucci G, Calin GA, Kornblau SM, Kantarjian H, Bloomfield CD, Andreeff M, Croce CM. MicroRNA signatures associated with cytogenetics and prognosis in acute myeloid leukemia. Blood. 2008;111(6):3183-9. PMID: 18187662. doi: 10.1182/blood-2007-07-098749.
  8. Marcucci G, Radmacher MD, Maharry K, Mrozek K, Ruppert AS, Paschka P, Vukosavljevic T, Whitman SP, Baldus CD, Langer C, Liu CG, Carroll AJ, Powell BL, Garzon R, Croce CM, Kolitz JE, Caligiuri MA, Larson RA, Bloomfield CD. MicroRNA expression in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 2008;358(18):1919-28. PMID: 18450603. doi: 10.1056/NEJMoa074256.
  9. Coskun E, von der Heide EK, Schlee C, Kuhnl A, Gokbuget N, Hoelzer D, Hofmann WK, Thiel E, Baldus CD. The role of microRNA-196a and microRNA-196b as ERG regulators in acute myeloid leukemia and acute T-lymphoblastic leukemia. Leuk Res. 2011;35(2):208-13. PMID: 20570349. doi: 10.1016/j.leukres.2010.05.007.
  10. Emmrich S, Katsman-Kuipers JE, Henke K, Khatib ME, Jammal R, Engeland F, Dasci F, Zwaan CM, den Boer ML, Verboon L, Stary J, Baruchel A, de Haas V, Danen-van Oorschot AA, Fornerod M, Pieters R, Reinhardt D, Klusmann JH, van den Heuvel-Eibrink MM. miR-9 is a tumor suppressor in pediatric AML with t(8;21). Leukemia. 2014;28(5):1022-32. PMID: 24270738. doi: 10.1038/leu.2013.357.
  11. Becker H, Marcucci G, Maharry K, Radmacher MD, Mrozek K, Margeson D, Whitman SP, Wu YZ, Schwind S, Paschka P, Powell BL, Carter TH, Kolitz JE, Wetzler M, Carroll AJ, Baer MR, Caligiuri MA, Larson RA, Bloomfield CD. Favorable prognostic impact of NPM1 mutations in older patients with cytogenetically normal de novo acute myeloid leukemia and associated gene- and microRNA-expression signatures: a Cancer and Leukemia Group B study. J Clin Oncol. 2010;28(4):596-604. PMID: 20026798. doi: 10.1200/JCO.2009.25.1496.

Erstellt von: Hehn (Informationszentrum) am 15.07.2015, letzte Änderung: 29.09.2015