Next Generation Sequencing

Die zunehmende Vielfalt klinisch relevanter molekularer Marker stellt eine große Herausforderung in der Diagnostik hämatologischer Neoplasien dar. Mit Hilfe moderner Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren, auch Next-Generation Sequencing (NGS) genannt, können parallel hunderttausende Genombereiche innerhalb einer Analyse untersucht werden. Das Amplicon deep-sequencing ermöglicht - je nach Entität - die gezielte Sequenzierung relevanter Genorte mit hoher Sensitivität. Für Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) oder myelodysplastischen Syndromen (MDS) sind Markerpanel mit ca. 30 relevanten Genen entwickelt worden.

Autoren: Torsten Haferlach, Ulrike Bacher, Alexander Kohlmann; MLL Münchner Leukämielabor GmbH (aus dem Rundbrief 18, Oktober 2013)

Bei Patienten mit hämatologischen Neoplasien sind der Karyotyp und das molekulare Mutationsprofil essentiell für prognostische Aussagen, die genaue Diagnose bzw. Klassifikation sowie die Therapiewahl, etwa hinsichtlich der Indikation zur allogenen Stammzelltransplantation bei AML [1-3]. In den letzten Jahren wurden zahlreiche neue Mutationen entdeckt, bei AML beispielsweise IDH1/2 [4], BCOR [5] oder DNMT3A [6], bei MDS etwa in der Spliceosom-Maschinerie Mutationen wie U2AF1, SRSF2 oder SF3B1 [7]. ASXL1, ETV6, EZH2, RUNX1 und TP53-Mutationen sind bei Patienten mit MDS prognostisch relevant [8]. Die Kombination verschiedener PCR-Techniken und der klassischen Sanger-Sequenzierung zur Darstellung dieser Mutationsvielfalt ist sehr aufwendig geworden. Die Hochdurchsatz-Sequenzierung, auch Next-Generation Sequencing genannt, ermöglicht nun die gleichzeitige Sequenzierung hunderttausender Genomabschnitte.

Die Möglichkeiten von Next-Generation Sequencing

Die Sanger-Methode [9] kam einer Revolution der genetischen Diagnostik gleich. Limitationen sind allerdings der hohe finanzielle, technische und zeitliche Aufwand sowie die limitierte Sensitivität. Next-Generation Sequencing (auch Hochdurchsatzsequenzierung oder second generation sequencing) ermöglicht eine immense Parallelisierung des Sequenzierungsprozesses. Aus der Vielzahl der NGS-Plattformen [10] soll beispielhaft die “454”-Technologie (Roche Diagnostics) angeführt werden, welche auf der massiv-parallelen Pyrosequenzierung basiert. Die zu sequenzierende DNA wird in einer Wasser-in-Öl-Emulsion an winzige Partikel (beads) gekoppelt. An diese immobilisiert werden die einzelnen DNA-Fragmente durch eine Emulsions-PCR (emPCR) klonal amplifiziert [11]. Ein bead trägt nach Ablauf der emPCR viele identische Kopien eines bestimmten DNA-Moleküls. Die beads werden in die Vertiefungen einer sogenannten Picotiter-Platte gefüllt. Die generierten Lichtsignale aus den verschiedenen Sequenzierzyklen während eines Sequenzierlaufes bilden ein flowgram, das anschließend in tatsächliche Sequenzabschnitte umgerechnet wird. Binnen zehn Stunden können hunderttausende DNA-Fragmente untersucht werden. Weitere Beispiele sind die Illumina-Technologie (Illumina) [12] und der Ion Torrent PGM™ Sequencer (Life Technologies) [13].

Amplicon deep-sequencing

Prinizipiell ist mit NGS eine Analyse des kompletten Exoms (whole-exome sequencing) oder Genoms (whole-genome sequencing) möglich, was jedoch technisch aufwendig und auch im Zusammenhang mit ethischen Fragen problematisch ist [14,15]. Für die hämatologische Routine-Diagnostik ist Amplicon deep-sequencing besonders geeignet, da diese Methode der Sanger-Kapillarsequenzierung sehr ähnlich ist [16-17]. Durch die Integration sogenannter molekularer Barcodesequenzen bzw. kurzer Gensonden (multiplex identifiers, MIDs) in die genspezifischen Primersequenzen kann man zahlreiche Patienten innerhalb einer Analyse mit hoher Abdeckung untersuchen. Anhand komplexer Datenverarbeitungsprogramme werden die Ergebnisse von Amplicon deep-sequencing nach dem Durchlaufen der sogenannten pipeline ausgewertet [18]. Die Sequenzvarianten müssen mit SNP- und Mutations-Datenbanken abgeglichen werden [19]. Als base calling bezeichnet man die digitale Zuweisung von Basenfolgen zu den jewei-ligen Signalen, die während der Sequenzierreaktion generiert werden. Zahlreiche Algorithmen wurden zur Erhöhung der Sequenziergenauigkeit entwickelt [20].

Einsatzmöglichkeiten von NGS für verschiedene hämatologische Entitäten

Pan-myeloisches Markerpanel für AML und MDS

Umfassende genetische Panels bereits bei Diagnosestellung [17] sind anhand von Amplicon deep-sequencing problemlos möglich. Für Patienten mit AML und MDS wurde angesichts des Überlappungsbereichs der molekularen Marker ein pan-myeloisches Panel mit mehr als 25 Markern entwickelt [21], welches u.a. NPM1, FLT3-TKD, RUNX1, EZH2, TET2, CBL, KRAS, DNMT3A, IDH1/IDH2, ASXL1 und TP53 einschließt. Dieses Panel muss mit konventionellen PCR-Analysen, z.B. auf MLL-PTD, PML-RARA, CBFB-MYH11 und RUNX1-RUNX1T1, kombiniert werden, da sich diese Mutationen nur eingeschränkt mit NGS-Assays abbilden lassen. Dieses Vorgehen bildet alle für die WHO-Klassifikation relevanten Marker ab [22]. Weitere Biomarker können flexibel integriert werden [7,8,23]. Die Sensitivität der Detektion von Mutationen durch NGS ist weitaus höher (1-2 %) als mit der Sanger-Sequenzierung (~ 20 %) [24]. Für Patienten mit RUNX1- und NPM1-mutierter AML wurde gezeigt, dass die MRD-Verlaufsdiagnostik gut mit NGS abgebildet werden kann [25,26].

CMML

Molekulare Mutationen wurden bei der Mehrheit der Patienten mit chronischen myelomonozytären Leukämien (CMML) anhand von NGS-Analysen detektiert [27], zuletzt bei > 90 % der untersuchten Fälle anhand eines Panels von nur neun Genen [28]. Besonders häufig sind Mutationen im SRSF2-Gen aus der Gruppe der Spliceosom-Mutationen, welche bei Patienten mit zusätzlicher RUNX1-Mutation prognostisch günstig sind [28] und zur Abgrenzung einer CMML von einer reaktiven Monozytose beitragen können. Der ASXL1-Mutationsstatus trägt zur Risikostratifizierung bei [29].

BCR-ABL1-Mutationsanalysen

Bei chronischer myeloischer Leukämie (CML) und bei Philadelphia-Chromosom positiver akuter lymphatischer Leukämie (Ph+ ALL) finden sich BCR-ABL1-Mutationen unter der Tyrosinkinaseinhibitor (TKI)-Therapie. Soverini et al. führten ultra-deep sequencing-Analysen an 33 Patienten mit CML oder Ph+ ALL durch, welche mehrfache Rezidive erlitten hatten und zumindest eine TKI-Resistenz-Mutation aufwiesen. Es zeigte sich, dass die Sanger-Sequenzierung den BCR-ABL1-Mutationsstatus bei 55 % der untersuchten Proben falsch einschätzte oder unterschätzte. Minor mutations mit einem Allel-Anteil von 1-15 % wurden nur durch ultra-deep sequencing entdeckt. Die Mehrheit der Proben zeigte anhand von ultra-deep sequencing ein Mosaik verschiedener BCR-ABL1-Mutationen. Diese Subklone wiesen im Verlauf der TKI-Therapie eine erhebliche Dynamik auf. Somit stellt ultra-deep sequencing einen vielversprechenden Ansatz für Patienten mit TKI-Resistenz dar [30].

Glossar

Amplicon

durch PCR vervielfältigtes DNA-Fragment

Amplicon deep-sequencing

Sequenzierung von Amplicons mit hoher Abdeckung und Sensitivität

Base calling

Zuweisung von Nukleotidsequenzen zu den generierten Signalen einer Sequenzierreaktion

Beads

kleine Partikel, an welche DNA immobilisiert werden kann

Emulsions-PCR

PCR in einer Wasser-in-Öl Emulsion

Flowgram

Kombination der Lichtsignale aus den verschiedenen Sequenzierzyklen

Multiplex identifiers (MIDs)

genetische Barcodes zur Patientenidentifikation

Next-Generation Sequencing (NGS)

nächste Generation der massiv-parallelen DNA-Sequenzierungstechnologie

Pipeline

automatisierte Abfolge von bioinformatischen Verarbeitungsschritten zur Interpretation der gewonnen NGS-Daten

Picotiter-Platte

Fiberoptische Platte als Sequenziergrundlage bei 454 Instrumenten

Pyrosequenzierung

Sequenzierverfahren, bei welchem nach Komplementierung der Basenpaare des Hauptstrangs mit den passenden Nukleotiden durch eine Enzymkaskade Chemoluminiszenz erzeugt wird

Ultra-deep sequencing

NGS-Verfahren mit besonders hoher Sensitivität

Whole-exome sequencing (WES)

Sequenzierung des gesamten Exoms

Whole-genome sequencing (WGS)

Sequenzierung des gesamten Genoms

Schlussfolgerungen

Angesichts expandierender Mutationsspektren ist die stufenweise Anwendung konventioneller molekularer Techniken eine zunehmende Herausforderung. Gleichzeitig gewinnen molekulare Marker an Bedeutung für die Klassifikation und Risikostratifizierung der Patienten mit akuten [31] und chronischen Leukämien. Die NGS-Methodik z.B. mittels Amplicon deep-sequencing erlaubt bereits jetzt eine Standardisierung und Katalysierung der hämatologischen Analytik. Anhand maßgeschneiderter Gen-Panels können Patienten mit AML und MDS umfassend charakterisiert werden. Ferner ermöglicht NGS neue Einblicke in die Rezidiventwicklung bzw. Resistenzmechanismen im Krankheitsverlauf, beispielsweise bei CML [30]. Aufgabe der kommenden Jahre ist es, für die verschiedenen Entitäten Algorithmen zur Integration von NGS in bereits bestehende molekular-diagnostische Arbeitsabläufe zu entwickeln und zu optimieren.

Referenzen und Quellen

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Erstellt von: Hehn (Informationszentrum) am 07.08.2014, letzte Änderung: 26.03.2015