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Molekularzytogenetische Techniken

Erstellt von: Hellenbrecht (Informationszentrum Projekt 2) , letzte Änderung: 22.06.2011

Einführung

Autor: Frau PD Dr. Anna Jauch, Stand: Oktober 2004

Molekularzytogenetische Techniken wie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), die Vergleichende Genomische Hybridisierung (comparative genomic hybridization, CGH) und 24-Farben-FISH-Analysen (Multiplex-FISH und SKY) haben in den letzten Jahren wesentlich zum Verständnis chromosomaler Veränderungen bei akuten und chronischen Leukämien beigetragen.

Die FISH-Technik (Abbildung 1) verbindet zytogenetische und molekulargenetische Techniken und ermöglicht durch die Hybridisierung ausgewählter DNA Sonden eine farbige Darstellung ganzer Chromosomen und chromosomaler Subregionen im Fluoreszenzmikroskop. Die Auswertung der FISH-Experimente erfolgt über hochsensitive Kamerasysteme und Computerprogramme für die digitale Bildbearbeitung, die selbst schwache Fluoreszenzsignale zuverlässig nachweisen können und damit die mikroskopische Auswertung deutlich vereinfachen. Vorteile gegenüber den klassischen Bänderungsanalysen sind die höhere Sensitivität (wenige Kilobasen) sowie der Nachweis chromosomaler Veränderungen direkt im Zellkern(Abbildung 2). Neben kommerziellen Sonden steht durch das "Human Genome Project" (Projekt zur Entschlüsselung des menschlichen Erbguts) eine wachsende Anzahl an kartierten DNA-Sequenzen zum Nachweis tumorrelevanter Chromosomenveränderungen zur Verfügung.

Abbildung 1: Prinzip der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Durch Hitzedenaturierung wird der DNA-Doppelstrang eines Chromosoms und einer markierten DNA-Sonde zum Einzelstrang aufgeschmolzen. Durch Temperaturerniedrigung kann die DNA-Sonde an die komplementäre Basensequenz der chromosomalen Ziel-DNA hybridisieren. Die Hybridisierungsstelle wird anschließend im Fluoreszenz-Mikroskop sichtbar gemacht.

Abbildung 2: Interphase-FISH eines ALL-Patienten

a.) Interphasekerne zeigen 3 grüne Hybridisierungs-Signale für die Sonde 14q23 und 4 rote Signale für die Sonde 6q27.

b.) Interphasekerne zeigen 2 grüne Signale für die Sonde 12p13 und nur 1 rotes Signal für die Sonde 9p23.

Bei der CGH-Analyse (Abbildung 3) werden Tumor- und Referenz-DNA mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert und auf Metaphasespreitungen eines gesunden Probanden hybridisiert. Chromosomenabschnitte, die im Tumorgenom über- bzw. unterrepräsentiert vorliegen, können mit dieser Technik rasch erkannt werden. Die Auswertung der CGH-Experimente erfolgt mit Hilfe hochsensitiver Kamerasysteme und spezieller Computerprogramme, die die Fluoreszenzintensitäten entlang der einzelnen Chromosomen messen und entsprechend als CGH-Profil (Abbildung 4) im Chromosomen-Ideogramm darstellen. Die CGH-Analyse ermöglicht die Identifizierung von Chromosomenregionen, die für die Tumorgenese von Bedeutung sind. Insbesondere der Nachweis von Amplifikationen kann Hinweise auf die Lokalisation neuer Onkogene geben. Deletionsregionen weisen dagegen auf die Lokalisation möglicher Tumorsuppressorgene hin. Die CGH-Technik hat allerdings auch methodische Limitierungen. So können Gewinne und Verluste erst ab einer Größe von ca. 10 Mbp analysiert werden. Dies entspricht in etwa der Größe einer Chromosomenbande. Da CGH nur eine Gewinn-Verlustbilanz erstellt, ist außerdem der Nachweis balancierter Chromosomenaberrationen nicht möglich. Darüber hinaus können Veränderungen, die nur in wenigen Zellklonen eines Tumors vorliegen, nicht sicher nachgewiesen werden.

Abbildung 3: Prinzip der Vergleichenden Genomischen Hybridisierung (CGH)

Unterschiedlich markierte Tumor- (grün) und Referenz- (rot) DNA werden im Verhältnis 1 :1 gemischt und auf Metaphasen einer gesunden Kontrollperson hybridisiert. Befinden sich in der Tumor- und Referenz-DNA gleich viele Kopien eines Chromosoms bzw. chromosomalen Abschnitts, so kommt es zu einer mehr oder weniger gleich starken Anfärbung mit beiden Farbstoffen (orange). Liegt im Tumor-Genom eine erhöhte Kopienzahl bestimmter DNA-Sequenzen vor, so zeigt der entsprechende Bereich eine stärkere Grünfärbung. Im Falle einer Deletion führt dies zu einer stärkeren Rotfärbung des Referenzchromosoms. Die Auswertung erfolgt durch die Aufnahme der einzelnen Fluoreszenzbilder an einem Fluoreszenz-Mikroskop mittels CCD-Kamera. Ein spezielles Computerprogramm bestimmt anschließend für jedes Chromosom entlang der Chromosomenachse den Fluoreszenzquotienten von Tumor- zu Referenz-DNA. Ein Wert von 1 entspricht einem balanzierten Chromosomenstatus, ein Wert von 0.75 zeigt den Verlust einer Kopie im Tumor-Genom und ein Wert von 1.25 den Gewinn einer Kopie im Tumorgenom an.

Abbildung 4: CGH-Profil eines Patienten mit adulter T-Zell-Leukämie (ATL)

Gewinne werden als grüne Balken rechts und Verluste als rote Balken links vom Chromosomen-Ideogramm angezeigt.

Durch die Entwicklung der 24-Farben-FISH-Techniken (Multicolor-FISH, M-FISH; und Spectral Karyotyping, SKY) mit chromosomenspezifischen DNA-Bibliotheken kann die Suche nach tumorrelevanten Chromosomenveränderungen wesentlich erweitert werden. Beide Techniken, M-FISH (Abbildung 5) und SKY, basieren auf einer kombinatorischen Markierungsstrategie der DNA-Sonden, so dass unter Verwendung von 5 unterschiedlichen Fluorochromen in genau definierten Kombinationen bis zu 31 verschiedene Farben erzielt werden können. Für die Auswertung der Vielfarben-FISH Experimente werden eine sensitive CCD-Kamera und spezifische Fluoreszenzfilter (M-FISH) bzw. ein Interferometer (SKY) verwendet. Spezielle Computerprogramme ermöglichen eine automatische Klassifizierung der Chromosomen anhand der spektralen Farbzusammensetzung. Die spezifische Darstellung der Chromosomen in unterschiedlichen Farben erleichtert insbesondere die Karyotypisierung von Tumormetaphasen (Abbildung 6) mit zahlreichen komplexen Umbauten, die mit klassischer Bänderungsanalyse nur unvollständig charakterisiert werden können. So kann die chromosomale Herkunft und Zusammensetzung von Markerchromosomen aufgrund der Klassifizierungsfarben eindeutig identifiziert werden. Im Vergleich zur CGH-Technik ist die 24-Farben-FISH-Analyse von der Qualität der Metaphasepräparate abhängig. Darüber hinaus können mit Hilfe chromosomenspezifischer DNA-Bibliotheken nur interchromosomale Umbauten in der Größenordnung einer Chromosomenbande (ca. 10 Mbp) nachgewiesen werden. Intrachromosomale Rearrangements wie Inversionen und Duplikationen werden anhand des Farbmusters nicht erkannt.

Abbildung 5: Prinzip der Multiplex-FISH Analyse (M-FISH)

a.) Alle chromosomenspezifischen DNA-Bibliotheken des Menschen werden mit unterschiedlichen Fluoreszenfarbstoffen markiert.
Jeder Farbstoff-Kombination wird eine bestimmte Klassifizierungsfarbe zugeordnet.
b.) Nach der Hybridisierung werden die einzelnen Fluoreszenzbilder mit spezifischen Filtern aufgenommen.
c.) Die Einzelaufnahmen werden zum Gesamtbild überlagert.
d.) Ein spezielles Computerprogramm erstellt aufgrund der Klassifizierungsfarben der Chromosomen ein Vielfarben-Karyogramm.

Abbildung 6: M-FISH Karyogramm eines AML-Patienten mit komplexen Chromosomenaberrationen

46,XX,t(4;20),t(5;7),del(6p),-7,+8,t(9;19),der(12)t(17;13;17;12),t(6;13),del(13q),t(4;17),t(9;19)

Protokolle

Autor: Prof. Dr. Harald Rieder, Universität Düsseldorf - nach dem Protokoll der AG Tumorzytogenetik, Philipps-Universität Marburg

Protokoll für FISH an Interphasekernen und Metaphasen mit direkt markierten Sonden

Protokoll für Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (52KB)

fishanleitung.pdf

Denaturierung von Metaphasen- oder Interphasezellkernen mit NaOH:

Die Objekträger sollten am Tag zuvor aufgetropft oder früher, dann bei -20°C gelagert oder am gleichen Tag, dann aber bei 60°C gealtert worden sein.

Denaturierung der OT

OT je 1 min in Ethanol rehydrieren

• 100%,
• 70%,
• 50%,
• 30%,
• 1 min 0,1x SSC, RT
• 30 min 2xSSC 70° (-80°)
• OT in heißem SSC (in Wasserbad) auf 37°C abkühlen lassen
• 1 min 0,1x SSC, RT
• 1-2 min in 0,07 N NaOH denaturieren (93 ml aqua dest. + 7 ml 1 N NaOH)
• (KM/B-Ausstriche 2 min)
• 1 min 0,1x SSC, eiskalt
• 1 min 2xSSC, eiskalt

Dehydrierung der Chromosomen/Kerne:

für 1 min jeweils in Ethanol

• 30%,
• 50%,
• 70%,
• 100%
• mind. 10 min lufttrocknen lassen
• fertig

Nun kann die denaturierte Sonde aufgetragen werden.

Denaturierung der Sonden:

(z.B. direkt markierte WCP- oder LSI-Sonden von Vysis)

ACHTUNG! Weitgehend abgedunkelt arbeiten

Am Vortag:

Prüfen, ob die gewünschten Hybrdisierungsproben vorhanden sind, Chromosomenpräparate erstellen oder eingefrorene Präparate auftauen lassen.

Am Tag der Hybridisierung

Vorbereitung:

• Wärmeplatte auf 45°C einstellen und Hybridisierungsbox (feuchte Kammer) anwärmen lassen
• OT denaturieren nach NaOH-Protokoll Hybridisierungsmix für z.B. SpectrumGreen/SpectrumOrange-Proben der Fa. Vysis herstellen
• · Eppis für die geplanten Hybridisierungsmixe richten; wenn eine Markierung für mehrere OT benötigt wird, das Gesamtvolumen ansetzen (je größer die zu pipettierenden Mengen, desto geringer der Pipettierfehler)
• Proben auf RT erwärmen
• kurz 1-3 sek. abzentrifugieren

pro Hybridisierungsfeld zusammenpipettieren auf 10 µl Endvolumen

• 7 µl Puffer + 2 µl aqua ad iniectabilia + 1 µl Probe (bei Doppelmarkierung 0,5 µl jeder Probe)

vortexen, kurz abzentrifugieren

• für 5 min bei 75° C im Wasserbad denaturieren
• bis zur weiteren Verwendung bei 45°-50°C halten (auf Wärmeplatte legen)
• OT auf 45°C Wärmebank für einige Minuten anwärmen lassen
• Mix komplett auf ein Hybridisierungsfeld auftragen und gleich mit Deckglas 22mmx22mm abdecken, sobald alle Hybridisierungfelder auf einem OT aufgetragen sind mit z.B. FIXOGUM versiegeln anschließend übernacht bei 37°C in Metallbox inkubieren (feuchte Kammer)

Tag nach Hybridisierung:

Vorbereitung: Wasserbad mit 200 ml Küvette mit 1xSSC, pH 7,0 auf 75 +/-1 °C vorheizen, 200 ml Küvette mit 2xSSC/0.1% Triton X100, pH 7,0 RT, richten

Vorgehen: eine Küvette mit 2xSSC, RT bereitstellen, Temperatur von 1xSSC, pH 7,0 auf 75 +/-1 °C prüfen, Deckgläser mit Pinzette von FIXOGUM befreien und vorsichtig von dem OT abziehen; OT bis zur weiteren Verwendung in 2xSSC stellen. Sobald alle OT ausgedeckt sind, OT für 5 min in 1 xSSC bei 75 +/--1 C° waschen: anschließend 5 min in 2xSSC/0.1% Triton geben, Färbung 2 min. in DAPI ohne Trocknung, einen Tropfen Antifade (z.B. Vectashield) auftragen und mit Deckglas eindeckeln, kühl und dunkel aufbewahren.

CGH-Protokoll für direkt markierte DNA

a. Markierung der DNA:

• pro 1 µg DNA zusammenpipettieren:
• 2.5 µl SpectrumGreen/Red dUTP 50 nmol/50 µl
• 5 µl dTTP
• 10 µl dNTP mix
• 5 µl 10x Puffer
• 10 µl Enzym
• 17,5 µl DNA (1 µg) + aqua
• ad 50 µl
• für 2 h bei 14°C inkubieren, anschließend Reaktion durch 10 min Erhitzen auf 70°C stoppen und auf Eis kühlen.

b. Denaturierung der OT:

• OT in 70% Formamid/2xSSC, pH 7.2, bei 70°C für 1-2 min inkubieren und sofort in -20°C 70% Ethanol geben
• dehydrieren in Alkoholreihe (70%, 85%, 100%, lufttrocknen
• oder
• OT je 1 min in
• 100%,
• 70%,
• 50%,
• 30% Ethanol rehydrieren
• 1 min 0,1x SSC, RT
• 10 min 2x SSC, RT
• 30 min 2xSSC 70° (-80°)
• OT in heißem SSC auf RT abkühlen lassen
• 1 min 0,1x SSC, RT
• 1 min in 0,07 N NaOH denaturieren (93 ml aqua dest. + 7 ml 1 N NaOH)
• 1 min 0,1x SSC, eiskalt
• 1 min 2xSSC, eiskalt

Dehydrierung der Chromosomen: für 1 min jeweils in

• 30%,
• 50%,
• 70%,
• 100% Ethanol
• 10 min lufttrocknen lassen

c. Hybridisierungsmix:

• 5 µl TEXAS-ROT-markierte DNA (100 ng)
• 10 µl FITC-markierte DNA (200 ng)
• 10 µl COT1-DNA (10 µg)

mischen

• + 2,5 µl NaAcetat 3 M

mischen

• + 70 µl EtOH 100%

mischen

• für 30 min einfrieren und anschließend 30 min bei 13 000 U/min abzentrifugieren, Überstand abkippen
• 2 x mit EtOH 70% spülen und abdampfen lassen
• in 7.5 µl Formamid 100%, deion. lösen
• mit 7.5 µl Mastermix (2xSSC, 20% Dextransulfat) mischen
• bei 73° C im Wasserbad für 10 min denaturieren
• 0,5-1h bei 37° C im Wasserbad renaturieren lassen
• auf OT mit denaturierten Chromosomen auftragen und mit 22x22 mm Deckglas abdecken und mit Fixogum versiegeln.
• 30 min antrocknen lassen und für 3 Tage in verdunkelter feuchter Kammer hybridisieren lassen

d. Tag nach Hybridsierungszeit:

• Wasserbad mit 100 ml Küvette mit 1xSSC, pH 7,0 auf 74°C vorheizen; 100 ml Küvette mit 2xSSC/0.1% Triton X100, RT, richten; eine 100 ml Küvette mit 2xSSC, RT bereitstellen.
• Temperatur von 1xSSC, pH 7,0 auf 75°C prüfen
• Deckgläser mit Pinzette von FIXOGUM befreien und vorsichtig von dem OT abziehen OT zum Ablösen der Deckgläser in 2xSSC stellen, sobald alle OT ausgedeckt sind, OT für 5 min in 1 xSSC bei 75° waschen. Anschließend für 5 min in 2xSSC/0.1% Triton waschen.min Färbung in DAPI, eindecken mit Antifade (z.B. VECTASHIELD).

Rezepte

DAPI-Stammlösung:

5 mg DAPI (z.B. Fa. Sigma) in 25 ml aqua dest. auflösen => 200µg/ml DAPI

Die Stammlösung wird in 0,5 - 1,0 ml Portionen in Eppendorff-Gefäße abgefüllt und bei -20°C aufbewahrt.

Zum Gebrauch werden 100 µl in 100 ml 4x SSC gegeben, das ergibt eine Gebrauchskonzentration von 200 ng/ml für die Gegenfärbung von FISH-Objektträgern; Färbedauer ca. 2 min in lichtundurchlässiger Färbeküvette. Lagerung im 4°C-Kühlschrank. Nach ca. 10 Hybridisierungsvorgängen wird die Gebrauchslösung verworfen.

20xSSC-Stammlösung:

175,32g NaCl (3M) und 97,0 gtri-Na-Citrat Dihydrat (0,33M) auswiegen, auf einen Liter destilliertes Wasser geben und vollständig auf dem Magnetrührer auflösen. Anschließend wird die Stammlösung autoklaviert oder steril filtriert. Zur Erstellung von 1xSSC, 2xSSC oder 4xSSC wird mit Aqua dest. herunterverdünnt. Lagerung bei Raumtemperatur für einige Monate. Vor Gebrauch immer erst austesten.