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Kulturtechniken

Erstellt von: Hellenbrecht (Infozentrum Projekt 2) , am: 12.02.2007, letzte Änderung: 12.02.2008

Autor: Prof. Dr. Harald Rieder, Universität Düsseldorf (nach Protokollen der AG Tumorgenetik, Philipps-Universität Marburg)

Kulturtechniken (18KB)

zellkultur.pdf

Zellkulturen von Knochenmark und peripherem Blut

Für alle Arbeiten sind puderfreie Handschuhe zu tragen, bei Arbeiten mit Fixativ zusätzlich Augenschutz. Es werden für den Kulturansatz nur sterile Materialien und Medien verwendet.

Kulturenansatz

Vorher vorbereitet:

ausgetestetes FCS im Kühlschrank auftauen lassen, in den vom Labor bevorzugten, sterilen 10 ml Zentrifugenröhrchen in 1 ml Portionen vorlegen (ev. Cytokine hinzugeben) und bis zur späteren Verwendung einfrieren

Rezept für Cytokine bei CML, AML und MDS (5KB)

wachstumsfaktorencmlamlmds.pdf

1. vor Kulturansatz vorportioniertes FCS auftauen lassen und Röhrchen beschriften
2. mit 4 ml RPMI-1640 oder McCoy´s 5a Medium (mit 1ml Antibiotic/Antimitotic auf 100 ml Medium, jeweils mit L-Glutamin und Bicarbonat, z.B. von Fa. Life Technologies) auf 5 ml ergänzen
3. Supplemente hinzugeben (Thymidin, PHA o.ä.)
4. pro Kultur maximal 0,5 ml KM-Aspirat oder Blut hinzugeben (in Abhängigkeit von der Leukozytenzahl im peripheren Blut). Bei < 10 000 Leukos /µl Kulturen gegebenenfalls doppelt anlegen und nach dem 1. Fixativ zusammenfügen
5. Material mit Serumpipette oder Spritze ohne aufgesetzte Nadel aufnehmen und in die Kulturröhrchen verteilen, auf keinen Fall Kanülen verwenden, da dadurch Bröckel und Zellklumpen zerrissen werden (Wachstumsfaktoren, Stromazellen!!). Auf keinen Fall Kügelchen von Reagenzienträger in die Kultur geben (Zerstörung der Zellen bei der Aufarbeitung). Um Restzellen aufzunehmen, die Röhrchen ggf. mit Kulturmedium ausspülen.

Kultivierung

1. Röhrchen verschraubt für 24h, 48h, und 72h bei 37° C in Wärmeschrank, schräg gestellt (mindestens 45°-Neigung) inkubieren, 4h-Kultur bei 37°C in Wasserbad.
2. Kuturen jeden Tag einmal kippen (nicht schütteln, da Zellen meist leicht am Boden anheften und nicht abgeschüttelt werden sollen; Wachstumsfaktoren, Stromazellen!!).

Ernte der Zellen und Präparation

Colcemidzeit

Lösungen:

hypotone KCl-Lösung 0,075 M, RT · Carnoy´s Fixativ (Abwandlung): Ethanol:Eisessig = 3:1, -20°C kalt

Vorgehen:

1. 0,1 ml Colcemid (z.B. von Fa. Life Technologies) zu den Kulturen geben, Röhrchen zum Mischen nur kurz kippen und für 2h bei 37°C inkubieren. Bei gallertigen Kulturen 50 µl DNAse (100 µg/µl in 50% Glycerin, z.B. von Fa. Boehringer) zugeben.
2. In der Zwischenzeit Objektträger in 100% Alkohol, vergällt, einlegen.
3. Kulturen nach Ablauf der 2h-Colcemid-Einwirkungszeit auf Vortex gründlich resuspendieren.
4. Bei 195 g für 7 min abzentrifugieren.
5. Überstand abschlürfen, ACHTUNG! Bei schlierigem Material ist ein frühzeitiges Aufwirbeln des Sedimentes möglich.
6. Sediment von Hand sorgfältig resuspendieren und Rundboden im Gegenlicht auf vollständige Resuspendierung prüfen (evtl. noch anhaftender Zellsaum!).
7. Auf Schüttler (z.B. Vortex) ca. 8 ml hypotone KCl-Lösung unter zügigem Schütteln (Vortex-Stufe 2) einlaufen lassen.
8. Auf homogenene Durchmischung prüfen.
9. Für 15 min bei RT einwirken lassen.
10. Bei 95 g für 10 min abzentrifugieren.
11. Hypotone KCl-Lösung wie oben beschrieben abnehmen.
12. Sediment vorsichtig von Hand resuspendieren und Rundboden im Gegenlicht auf noch anhaftenden Zellsaum prüfen.
13. 0,5 ml eiskaltes Fixativ wie folgt zugeben:
14. - Röhrchen auf Vortex mit Stufe 1 schütteln lassen (Frequenz sollte schnellem Schütteln von Hand entsprechen)
15. - während des Schüttelns etwa 1 Tropfen Fixativ pro Sekunde eintropfen lassen. Nach 20-30 Tropfen (0,5 ml, sollte ca. 30 sec dauern) kann schneller zugegeben werden (Unbedingt einhalten, da sonst keine homogene Durchmischung mit Fixativ erfolgt und die denaturierten Proteine nicht gleichmäßig verteilt werden).
16. - bei mehreren Röhrchen alle erst der Reihe nach derart versorgen, dann mit 7 ml Fixativ (Vortex Stufe 2) auffüllen.
17. - auf homogene Durchmischung prüfen.
18. Bei ca. 160 g für 7 min abzentrifugieren,
19. Überstand abschlürfen.
20. Sediment resuspendieren.
21. 7 ml Fixativ zugeben.
22. Schritt XIV-XVII zweimal wiederholen.
23. Während der 2. Waschung OT aus Alkohol nehmen und 3x mit aqua demin. spülen, dann mit aqua bidest. 1x spülen und in aqua bidest. stehen lassen. Mit Eiswürfeln aus aqua bidest. versehen und in den Kühlschrank stellen.
24. Nach dem 3. Waschen Überstand so weit wie möglich abnehmen (s.o.).
25. mit Pipette Sediment vorsichtig aufwirbeln und aufziehen (dabei pro Patient eine Pipette benutzen und gleich für späteres Auftropfen vorsehen
26. Achtung Ausnahme! PHA-Kulturen immer pro Patient mit eigener Pipette pipettieren und auftropfen, da es sich hierbei um andere Zellen des Patienten handelt).

Trübung prüfen:

• die Suspension sollte für das Auftropfen auf die Objektträger mäßig trübe und noch durchsichtig sein, Zellen sind dann im Gegenlicht als Schwebstoffe zu erkennen
• keine Zellen erkennbar (bei vorsichtigem Pipettieren keine Teilchen zu sehen) => Kulturen desselben Materials zusammenfügen (ACHTUNG: Bei der Prüfung von Wachstumsfaktoren die unstimulierte Parallelkultur immer getrennt halten - i.d.R. RPMI1640- andernfalls ist keine Aussage über Wirksamkeit möglich), 5 ml Fixativ zugeben und noch einmal abzentrifugieren, dann auftropfen
• zu dicht (Suspension ist milchig) => mit Fixativ verdünnen bis eine mäßige Trübung erreicht ist

Auftropfen der Suspension

1. Wenn Zellsuspensionen eingestellt sind, OT aus dem Kühlschrank nehmen. Eisstückchen sollten noch auf dem Wasser schwimmen. Gegebenenfalls ergänzen.
2. Suspension vor dem Auftropfen noch einmal kurz anpipettieren, damit abgesunkene Zellen wieder gemischt werden.
3. OT aus dem Wasser nehmen, überschüssiges Wasser seitlich kurz abkippen.
4. OT flach (in der feuchten Kammer, die auf einer 37°C Wärmeplatte steht) hinlegen und mit senkrecht gehaltener Pipette mäanderförmig 7-9 Tropfen Suspension auftropfen. Dabei am dem Mattrand entgegengesetzten Ende mit einem Abstand von ca. 2 cm beginnend zum Mattrand hin auf etwa 20 cm Tropfhöhe steigern (manche Zellen spreiten sich schlecht, so daß mit höherer Auftropfdistanz eine bessere Spreitung erreicht wird. Umgekehrt können manche Zellen leicht zersprengen, das durch eine geringere Auftropfdistanz vermindert werden kann. Durch die unterschiedliche Distanz werden beide Phänomene berücksichtigt, das ist besonders wichtig, wenn das Material nur für einen OT reicht. Daraus folgt, daß bei der anschließenden Analyse die Durchmusterung der OT über die Länge statt wie sonst üblich über die Breite erfolgen sollte).
5. nach dem Auftropfen überschüssiges Fixativ auf dem Mattrand mit Papiertuch abtupfen, dann seitlich abkippen, OT aufnehmen und am Rand des OT zusammengelaufene Flüssigkeit mit Tuch vorsichtig abtupfen.
6. OT beschriften und noch etwas in der feuchten Kammer liegend den Eisessig und das Ethanol abdampfen lassen, anschließend lufttrocknen (auf keinen Fall auf Wärmeplatte, unter Wärmequelle o.ä. legen, da sonst die Zellen und Chromosomen abschwimmen).
7. OT nach Trocknung an Phasenkontrast-Mikrokop auf ausreichende Zelldichte und Metaphasen prüfen.
8. verbliebene Zellsuspension nach Patient und Material zusammenpipettieren, mit Fixativ auffüllen und mit sauberem Deckel zuschrauben. Deckel mit Nr. versehen und einfrieren.
9. nicht verbrauchte OT sind zu verwerfen. Auf keinen Fall für weitere Präparationen am nächsten Tag aufbewahren.

Erstellen weiterer Chromosomenpräparate ("Nachtropfen" von Objektträgern)

Da am Mattrand eher hoch aufgetropfte Metaphasen sind, am anderen Ende dagegen niedrig aufgetropfte Zellen, muß anhand bereits erstellter OT die Metaphasenqualität in Abhängigkeit von ihrer Lage auf dem OT geprüft werden, so daß die neuen Präparate jenachdem von vorneherein eher nur hoch oder eher nur niedrig aufgetropft werden. Hierzu genügt u. U. ein Blick auf die fotografierten Metaphasen und die dazugehörigen Fotozettel, da anhand der Koordinaten die Lage der fotografierten Metaphasen klar wird. Auf keinen Fall mittels weitere Zugabe von Essigsäure die Chromosomenspreitung zu verbessern suchen. Dies ist fatal für die GAG-Bänderung!

Direktpräparation von Knochenmark und peripherem Blut

1. Je nach Anzahl der Leukozyten im letzten Blutbild des Patienten werden zu gleichen Teilen unsteril das Untersuchungsmaterial und aqua ad iniect. gemischt. In der Regel werden 2 ml Material + 2 ml (oder mehr) aqua iniect. verwendet und zwei Zentrifugenröhrchen angelegt.
2. Anschließend bei 95g für 10 min abzentrifugieren, Überstand abschlürfen.
3. Eiskaltes Fixativ wie folgt zugeben:
4. - Sediment von Hand resuspendieren
5. - Röhrchen auf Vortex mit Stufe 2 schütteln lassen und 7 ml eiskaltes Fixativ schnell hinzugeben (unbedingt einhalten, da aufgrund der großen Knochenmark- oder Blutmenge sonst keine homogene Durchmischung mit Fixativ erfolgt und die denaturierten Proteine nicht gleichmäßig verteilt werden).
6. - bei mehreren Röhrchen alle der Reihe nach derart versorgen.
7. - auf homogene Durchmischung prüfen.
8. Bei ca. 160 g für 7 min abzentrifugieren,
9. Überstand abschlürfen.
10. Sediment resuspendieren.
11. 7 ml Fixativ zugeben.
12. Schritt IV-VII zweimal wiederholen.
13. Wie gewohnt Präparate herstellen.

Achtung! Wichtige generelle Anmerkungen

Zentrifugation

Für Labofuge R: alle nun folgenden Zentrifugationen erfolgen mit langsamer Beschleunigung, damit die Zelle möglichst im Zentrum des Rundbodens der Röhrchen landen und der Überstand so weit wie möglich abpipettiert werden kann. Deshalb die Bremse beim Anlaufen inaktivieren und nach Erreichen der erwünschten Drehzahl wieder einschalten. Bremsabschaltzeitpunkt auf "0" setzen.

Pipettieren

Für Abschlürfen des Überstandes nur Pasteurpipetten mit glatter Pipettenspitze verwenden, damit das Sediment nicht frühzeitig aufgewirbelt wird. Für eine exakte Beobachtung des Sedimentes immer eine Lichtquelle als Hintergrund verwenden. Abschlürfen des Kulturmediums und der hypotonen KCl-Lösung immer entlang des Meniskus unter genauer Kontrolle des Sedimentes, da Proteinschlieren ein frühzeitiges Aufwirbeln des Sedimentes verursachen können. Abschlürfen des Fixativ bei Waschschritten nur bis zu Beginn der Bodenrundung; Abschlürfen des Fixativ nach letztem Waschschritt vor Auftropfen der Suspension soweit wie möglich. Hierzu nach Erreichen der Rundung des Bodens langsam entlang des Meniskus das Fixativ abschlürfen. Dabei die Pipette kaum noch bewegen. Durch das eigene Zittern kommt immer noch genug Fixativ in die Pipette. Gequollene Zellen sind außerordentlich fragil. Daher nach hypotoner Lösung und vor Fixierung auf keinen Fall die Suspension auf und ab pipettieren. Fixierte Zellen nur so viel wie unbedingt nötig durch die Pipette bewegen. Kein unnötiges Aufnehmen oder Durchpipettieren der Suspension. Alle Pipettieraktionen so selten und schonend wie möglich. Auf keinen Fall die Supension vehement pipettieren.

Unterbrechungsmöglichkeiten des Präparationsvorganges

Sobald die Colcemidzugabe erfolgt ist, kann eine Unterbrechung der Präparation erst nach dem 1. Fixierungsgang erfolgen. Sollte die Präparation vor dem 3. Fix-Waschgang unterbrochen werden, die Zellen auf keinen Fall einfrieren, sondern in den Kühlschrank stellen. Zellen können im Kühlschrank 1-2 Tage stehen. Erst nach dem 3. Fix-Vorgang können die Zellen eingefroren werden. Fixierte Zellen sind bei -20°C in Fixativ gelagert über 10 Jahre halbar