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Chromosomenbandenanalysen

Erstellt von: Hellenbrecht (Infozentrum Projekt 2) , am: 12.02.2007, letzte Änderung: 12.02.2008

Autor: Prof. Dr. Harald Rieder, Universität Düsseldorf

Chromosomenbandenanalysen

Die Bänderung von Chromosomen ermöglicht im Gegensatz zur einfachen (konventionellen) Giemsa-Färbung (Sortierung der Chromosomen nach Habitus und Größe) eine eindeutige Identifikation der einzelnen Chromosomen. Je nachdem welche Färbemethode angewendet wird, werden unterschiedliche Bereiche im Chromosom hell oder dunkel angefärbt. Anhand des so entstandenen, für jedes Chromosomenpaar typischen Bandenmusters, kann je nach Bandenstadium (bphs: bands per haploid set) eine Zuordnung stattfinden; numerische und strukturelle Aberrationen können identifiziert werden.

Die in der Tumorzytogenetik am häufigsten verwendete Methode ist die G-Bänderung mit Giemsa-Farbstoff.

G-Bänderung

Acetic Saline und Giemsa (ASG)/(GAG)-Chromosomenbanden-Färbung 1-2

(Protokoll der AG Tumorgenetik, Philipps-Universität Marburg) modifiziert nach Fonatsch 3

Präparate:

konventionelle Chromosomenpräparationen 1-3 Tage altern lassen, notfalls 1h bei 60° backen

Lösungen:

• Acetic saline
• 0,03 M tri-Natrium-Citrat-Dihydrat 8.82 g
• 0,095 M NaCl 5,53 g
• ad 1l aqua dest
• Kühl lagern, nicht länger als 4 Wochen verwenden.
• Giemsa-Färbelösung, 5%
• 95 ml Phosphatpuffer pH 7,0 aus
• 1,14g Na2HPo4 x 2 H2O (Natrium-2-Hydrogenphosphat
• 0,49g K2H2PO4 (Kaliumhydrogenphosphat
• ad 1l aqua dest, pH 6,8
• + 5 ml Giemsa-Lösung

Material:

30 ml Plastikküvetten mit Schraubverschluß (z.B. Merck Best.-Nr. 631A9150)

Vorgehen:

1-2 OT in Küvette stellen, mit Acetic Saline bis zum Mattrand auffüllen und Deckel aufschrauben bei 59°C 6-16h inkubieren.

OT aus Acetic Saline nehmen, OT bei Raumtemperatur für 2-3 min. in Giemsa-Färbelösung färben (erst die OT in die Färbeküvette, dann die Färbelösung zugeben, nach der Färbedauer abkippen, so zieht sich keine schlierige Schicht auf den OT), stehend lufttrocknen, anschließend Kontrolle der Färbung am Mikroskop (falls nicht ausreichend, für einige Minuten in der Giemsa-Färbelösung nachfärben). Für mindestens 30 min. bei 59°C im Wärmeschrank trocknen, anschließend in z.B. Corbit o.ä. eindecken.

Anmerkungen:

• Küvetten wegen evtueller Verpilzung alle 3 Monate autoklavieren
• funktioniert nur mit verschraubbaren Plastikgefäßen
• Haltbarkeit der Präparate >10 Jahre

C-Bänderung

C-Banden-Darstellung mit Giemsa-Farbstoff zur Sichtbarmachung der zentromerischen Regionen der Chromosomen

Präparate:

Es können ungefärbte, ca. einen Tag gealterte Präparate, oder vorher Fluoreszenz (R- oder Q-Banden) gefärbte und in Ethanol 96% entfärbte Präparate verwendet werden.

Vorbereitungen:

• 0.2 N HCl frisch ansetzen (RT)
• 5% BaOH: 5 g BaOH mit 100 ml A.dest. auf dem warmen Magnetrührer mischen, bis zum Gebrauch rühren lassen (schwer löslich)
• 2xSSC: aus 20xSSC verdünnen
• Sörensen-Puffer pH 6,8
• Giemsa 14%: 14 ml frisch gefilterte Stammlösung mit 86 ml Sörensen-Puffer pH 6,8 mischen

Alle Lösungen werden nach dem Gebrauch verworfen

Durchführung:

Trockene Präparate werden bei Raumtemperatur 50-60 Minuten in 0.2N HCl gestellt, anschließend für 5 min. bei RT in 5% BaOH stellen, danach gründlich unter Leitungswasser abspülen(alle seifigen Flocken entfernen). Im Anschluß daran werden die Präparate für 60 min. bei 60°C in der 2xSSC inkubiert. Danach werden sie in Sörensen Puffer pH 6,8 bei Raumtemperatur abgespült und abgekühlt. Jetzt werden die noch feuchten Präparate für 30 min. in der 14%igen Giemsalösung gefärbt (erst die Präparate in die Küvette stellen, dann die Färbelösung zugeben). Die Präparate unter fließendem Wasser abspülen und stehend trocknen lassen. Färbung im Durchlicht prüfen, wenn die Färbung gelungen ist, ggf. mit Corbit eindeckeln.

Rezepte:

• SSC (Saline Sodium Citrate = salziges Natriumzitrat) Stammlösung 20 x SSC: 175,3g/l Natriumchlorid + 88,2g/l Natriumcitrat in Aqua. dest. lösen
• HCl 0.2 N: HCl 2N, 1 Teil + 9 Teile Aqua dest.
• BaOH 5% (5 g BaOH/100ml Aqua dest.) - Sörensenpuffer pH 6,8:
• Na2HPO4, di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat, MG 177,99 (12,4 g/l)
• KH2PO4, Kaliumdihydrogenphosphat z.A., ISO,MG 136,09 (9,53 g/l)
• beide Lösungen 1 + 1 mischen (50ml + 50 ml)

Weitere Möglichkeiten zur Sichtbarmachung der Zentromere sind das Anfärben mit DAPI, sowie gleichzeitges Färben mit Distamycin und DAPI (dabei erhält man gleichzeitig R- und C-Banden).

Q-Bänderung

Achtung: Quinacrin ist mutagen, Vorsicht beim Umgang.

Präparate:

Es können frische oder ältere, vorher konventionell Giemsa-gefärbte und anschließend entfärbte, vorher R-gebänderte und entfärbte Präparate verwendet werden (nach dem Entfärben sollten sie mindestens 2 Stunden bis über Nacht in 96% Ethanol im Kühlschrank gestanden haben).

Die entsprechenden Metaphasen werden am besten schon vorher im Durchlicht an konventionell Giemsa-gefärbten Präparaten oder im Phasenkontrast (ungefärbt) gesucht und notiert.

Vorbereitungen:

• Es werden trockene Präparate verwendet.
• Alle Lösungen bereitstellen:
• Quinacrine-Gebrauchslösung (aus dem Kühlschrank)
• Ethanol (96%, frisch), aqua iniect. (frisch), McIlvaine's Puffer pH 4,8 (frisch, 2 Küvetten).
• Fluoreszenzmikroskop (50W) mit Zeiss-Filter 09 rechtzeitig einschalten (ca. 10 min vorher), Deckgläschen und Tücher bereitlegen.

Durchführung:

Präparate in die Quinacrinlösung stellen , mindestens 45 Minuten färben.
Präparate aus der Farbe nehmen, Farbe ablaufen lassen, nacheinander spülen in:

• Ethanol 96%
• Wasser
• Puffer
• Puffer

Auf das nasse Präparat ein Deckgläschen legen (am besten senkrecht fallen lassen, Luftbla-sen vermeiden), überschüssigen Puffer im Trockenblock ausdrücken. Das Präparat kann sofort verwendet werden.
Die Präparate werden in einer feuchten Küvette (McIlvaine´s Puffer) im Kühlschrank aufge-hoben, ggf. kann erneut mikroskopiert werden.

Rezepte:

• Mc Ilvaine's Puffer: puffert im sauren Bereich
• 0,1 M Citronensäure-Monohydrat MG 210,14
• 0,2 M di-Natriumhdrogenphosphat-Dihydrat MG 177,99
• 21,0 g Citronensäure auf 1 l aqua bidest und 35,6 g di-Natriumhydrogenphosphatauf 1 l aqua bidest, die Lösungen werden bei Raumtemperatur aufbewahrt.
• Puffer mit pH 4,8:
• 1 Teil 0,1 M Citronensäure + 1 Teil 0,2 M diNatriumhydrogenphosphat
• Puffer mit pH 7,0: 1 Teil Citronensäure+ 2 Teile di-Natriumhydrogenphosphat
• Quinacrine Mustard (z.B. Sigma,Q-2876)für die Gebrauchslösung 0,05 % in Mc Ilvaine's Puffer pH 4,8:
• 100 mg (Verpackungseinheit) in 200 ml Puffer lösen (giftig, nicht einatmen, Handschuhe tragen), im Dunkeln filtern, in lichtundurchlässige Behälter füllen, im Kühlschrank aufbewahrt monatelang haltbar, ev. zwischendurch erneut filtern.

Fluoreszenz R-Bänderung

mit Chromomycin A3 und Methylgrün

Achtung: alle verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind mutagen, Vorsicht im Umgang.

Präparate:

Es können unvorbehandelte oder vorher konventionell Giemsa-gefärbte und anschließend wieder entfärbte Präparate verwendet werden (2 Stunden bis über Nacht in 96%-Ethanol). Am besten werden vor der Färbung geeignete Metaphasen im Phasenkontrast oder Durchlicht gesucht und notiert.

Durchführung:

Das trockene Präparat mit 3-4 Tropfen Chromomycin A3-Gebrauchslösung beschichten, Deckgläschen blasenfrei auflegen, in eine dunkle Kammer legen, 30 min (oder länger) bei RT färben.
Anschließend das Deckgläschen vorsichtig abheben, 5 min. in frischer Methylengrün-Gebrauchslösung in lichtundurchlässiger Küvette färben, 2x mit Glycerin für Fluoreszenz-mikroskopie abspülen, mit einem Deckgläschen eindeckeln und bis zur Verwendung in eine dunkle Kammer legen.
Fluoreszenzmikroskop 50W mit Zeiss-Filter 05 (ca. 10 min vorer) einschalten.
Die gebänderten Metaphasen können in der Regel sofort oder nach ein bis drei Tagen im Kühlschrank (eventuell bessere Bänderung) angesehen werden.

Die Färbung wird erst durch das UV-Licht der Fluoreszenzbirne angeregt (ausreifen), nach wenigen Sekunden im UV-Licht werden die Banden immer heller bis die Metaphase 'wegzubrennen' beginnt und kein Kontrast mehr zu sehen ist. Dieser Vorgang ist irreversibel und abhängig von der Betriebsdauer der Lampe und deren Wattzahl.

Die Präparate werden in einer feuchten Küvette (McIlvaine´s Puffer) im Kühlschrank aufbewahrt; sie sind dort lange haltbar und zeigen auch nach Wochen noch zufriedenstellende Ergebnisse.

Entfärbung:

Falls der gleiche OT anschließend für Q-Banden gefärbt werden soll:

Objektträger 3x in absolutem Ethanol (100%) waschen und anschließend nacheinander in Carnoy`s Fixativ und A. dest. spülen. Bis zur weiteren Bearbeitung in 96%igem Ethanol aufbewahren.

Rezepte:

• Chromomomycin A3 (z.B Sigma C-2659):
• 5mg sorgfältig in 10 ml Sörensen-Puffer pH 6,8 lösen, gekühlt und dunkel monatelang haltbar.
• Methylgrün (z.B. Sigma M-8884) Stammlösung:
• 1g in 50 ml Mc Ilvaine´s Puffer geben ( 31 ml Citronensäurelösung + 19 ml di-Natriumlösung). Die Methylengrün-Stammlösung ist gekühlt lange haltbar.
• McIlvaine Puffer pH 7,0 frisch ansetzen:
• 1 Teil Citronensäurelösung + 2 Teile di-Natriumhydrogenphosphatlösung
• Methylengrün-Gebrauchslösung:
• 1 ml Stammlösung + 49 ml McIlvaine's Puffer pH 7,0

Fluoreszenz R- und C-Bänderung

(Protokoll nach A. Knopp, Universität Rostock)

Fluoreszenz R- und C-Bänderung (10KB)

knopprcbaenderung.pdf

Benötigte Farbstoffe :

• Chromomycin A3 (z.B. Fa. Serva 17148)
• Distamycin A-HCl (z.B. Fa. Serva 20722)
• DAPI (z.B. Fa. Serva. 18860)

Benötigte Puffer:

• Mc Ilvaine´s Puffer mit Zitronensäure 0,1M und Na2HPO4 0,2M, pH 7,0
• A)21,01g Zitronensäure-1-Hydrat/l
• B)35,6g di-Natriumhydrogenphosphat-2Hydrat/l
• =>18ml A + 82ml B
• 1M MgCl2-Stammlösung
• 20,33g MgCl2x6H2O in 100ml Aqua dest. lösen
• McIlvaine´s Puffer mit MgCl2, 5mM
• 99,5ml McIlvaine´s Puffer
• 0,5ml MgCl2-Stammlösung

Färbeverdünnungen:

Chromomycin A:

McIlvaine´s Puffer/MgCl2 1:1 mit Aqua dest. verdünnen, Chromomycin A3 in einer Konzentration von 0,5 mg/ml darin auflösen. Puffer langsam zum Chromomycinpulver zugeben und über Nacht bei 4°C ruhig stehen lassen; im Kühlschrank lichtgeschützt lagern.

Distamycin A:

Distamycin A mit McIlvaine´s Puffer auf 0,05 - 0,1 mg/ml verdünnen; bei -20°C lagern.

DAPI:

Stammlösung: DAPI in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in Aqua dest. lösen, portionieren, bei -20°C lagern.
Gebrauchslösung: Stammlösung 1 : 10 McIlvaine´s Puffer auf 0,01 mg/ml verdünnen.
Zur Färbung der Chromosomen auf die luftgetrockneten Objektträger einen dicken Tropfen Chromomycin mit 10% Paraformaldehyd geben, mit einem Deckglas luftblasenfrei einde-cken, 2 Stunden in einer feuchten Kammer färben. Anschließend mit Aqua dest. abspülen und trocknen.
Objektträger mit Distamycin eindecken, 10 - 15 min färben, mit Aqua dest. abspülen und trocknen.
Objektträger mit DAPI eindecken, 20 min färben, anschließend mit Aqua dest. abspülen und trocknen. McIlvaine´s Puffer/MgCl2 1:1 mit Glycerin verdünnen, die Objektträger mit einem Tropfen eindecken, im Filterblock gut ausdrücken und mit Klebstoff luftdicht verschließen.
Die Banden sind nach 3 Tagen Lagerung der OT im Kühlschrank am besten.
Benötigte Filter (Zeiss Axiophot):