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Erstellt von: Hellenbrecht (Infozentrum Projekt 2) , am: 09.02.2007, letzte Änderung: 12.02.2008
Definition und zytogenetische Diagnostik
Autor: Prof. Dr. Harald Rieder, Universität Düsseldorf
Die Zytogenetik befasst sich als Zweig der Genetik mit den ursächlichen Beziehungen zwischen den rein phänomenologischen Vererbungserscheinungen und den Strukturen, Verteilungsvorgängen und Veränderungen der erbguttragenden Zellorganellen.
Die zytogenetischen Untersuchungen bei Leukämien erfolgen fast ausschließlich an Chromosomen. Chromosomen befinden sich im Zellkern. Sie bestehen aus Desoxyribonucleinsäure (=DNS, engl. DNA) und Proteinen und stellen die Träger der genetischen Information dar. Sie sind zwischen den Teilungsphasen der Zelle, d.h. in der Interphase des Zellzyklus, also in dem vom Standpunkt des Zellzyklus aus als "Ruhekern" bezeichneten, jedoch stoffwechselaktiven "Arbeitskern" nicht als solche mikroskopisch darstellbar. Erst bei der Kernteilung (Mitose) werden sie infolge Verdichtung (Kondensation) des Chromatins als fädige Strukturen sichtbar und sind insbesonder als Metaphasechromosomen lichtmikrokopisch erkennbar. Demzufolge werden unterschiedliche Techniken der Chromosomenanalyse eingesetzt.
Bei teilungsaktiven Zellen können die Chromosomen in der Metaphase der Zellteilung untersucht werden, wenn die Chromosomen voneinander abgrenzbar vorliegen und nach differentieller Anfärbung anhand charakteristischer Querstreifenmuster identifizierbar sind (Chromosomenbanden). In diesem Zustand können die Chromosomen einzelner Zellen hinsichtlich Anzahl (numerisch) und Gefüge (strukturell) auf Abweichungen untersucht werden. Hierzu werden je nach Fragestellung unterschiedliche Techniken der Chromosomenbandendarstellung sowie der molekularen Zytogenetik angewandt. Das Auflösungsvermögen der Metaphasechromosomenanalyse hängt von der Qualität der Chromosomenpräparation und den sich anschließenden Verfahren zur Darstellung der Chromosomenbanden ab. Alleine die numerische Auswertung setzt schon voraus, dass die Metaphasechromosomen im Präparat voneinander abgrenzbar ausgebreitet vorliegen. Zur Identifizierung der hinzugewonnenen oder fehlenden Chromosomen müssen die Chromosomen darüber hinaus anhand der ihnen eigenen Bandenmuster eindeutig identifizierbar sein. Veränderungen der Chromosomenstruktur sind an Abweichungen der Chromosomenmorphologie und einem andersartigen Muster der Chromosomenbanden erkennbar. Bei der Darstellung dieser Bandenmuster können in Abhängigkeit vom Kontraktionszustand der Chromosomen unterschiedliche Auflösungen errreicht werden. Während bei der Analyse von Metaphasechromosomen künstlich zur Teilung angeregter normaler Lymphozyten im Mittel 400 Banden pro haploidem Chromosomensatz mühelos erzielt werden, ist bei Chromosomenpräparationen aus Leukämiezellen eher eine Auflösung von 150 Banden die Regel.
Untersuchungen an Interphasezellkernen erfolgen mit molekularzytogenetischen Methoden unter Anwendung der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH). Für die FISH-Analyse an Interphasezellkernen werden je nach Fragestellung Chromosomenregion- oder Gen-spezifischen Sonden eingesetzt. Sie erlaubt die Bestimmung von Veränderungen der Kopienzahl der jeweiligen Bereiche. Dabei kann eine numerische Veränderung auch eine Aufteilung der eingesetzten Sonde durch eine Stückverlagerung, Translokation, anzeigen. Zum verbesserten Nachweis von Translokationen an Interphasezellkernen werden den chromosomalen Bruchpunkten benachbarte und unterschiedlich eingefärbte Sonden eingesetzt, so daß Zellen mit einer Translokation an der Lage der Sonden zueinander identifiziert werden können. Dabei können die Sonden z.B. so gewählt werden, daß in einer Zelle mit einer Translokation durch die enge Zusammenlagerung der unterschiedlichen Farbsignale eine partielle Farbänderung auftritt.
Bei dieser Sonderform der zytogenetischen Analyse fungiert die komplette DNA des zu untersuchenden Gewebes als Sonde, um durch in situ-Hybrisierung an normalen Metaphasechromosomen Veränderungen in der genetischen Zusammensetzung aufzuspüren. Daher handelt es sich um eine Technik der umgekehrten, reversen in situ-Hybridisierung. Dabei wird DNA normaler Zellen als Referenz verwendet und mit der zu testenden DNA verglichen (vergleichende genomische Hybridisierung engl. comparative genomic hybridization CGH). Hierzu werden Referenz- und Test-DNA unterschiedlich mit Fluoreszenz-Farbstoffen markiert und im Verhältnis 1:1 gemischt. Diese Mischung dient dann als Sonde für die in situ-Hybridisierung an Metaphase-Chromosomen von Lymphozyten gesunder Spender. Bei der Anlagerung von korrespondierenden DNA-Abschnitten der DNA-Mischung an die Metaphasechromosomen kompetieren die Anteile aus der Test- und Referenz-DNA um Bindung. Liegen alle Chromosomenabschnitte der Test- und Referenz-DNA im gleichen Verhältnis vor, so kommt es zu einer homogenen Misch-Anfärbung der Chromosomen. Bestehen jedoch in der Test-DNA im Vergleich zur Referenz-DNA Zugewinne einzelner Chromosomenabschnitte, so färbt sich der betreffende Abschnitt des Metaphasechromosoms vermehrt in der Farbe der Test-DNA an. Fehlen in der Test-DNA Segmente, so überwiegt an der entsprechenden Stelle die Färbung der Referenz-DNA. Die Ausprägung der Fluoreszenz-Unterschiede hängt dabei von der Größe des veränderten Chromosomenabschnitts und dem Anteil der Tumorzellen in der Probe ab, aus der die Test-DNA gewonnen wurde. Während durch grobe und ausgeprägte genomische Imbalanzen ausgelösten Veränderungen der Fluoreszenz-Intensitäten am Mikroskop mit bloßem Auge erkennbar sind, können kleinere Verschiebungen der Fluoreszenz-Färbungen nur mit Hilfe einer Rechner-gestützten digitalen Analyse der Farbzusammensetzung aufgedeckt werden.
Printing Date: 17.05.2012 © 2006-8 ELIC European Leukemia Information Center
