Das Kieler GMALL-Referenzlabor - bald in neuen Räumlichkeiten

Das Kieler Labor für hämatologische Spezialdiagnostik der II. Medizinischen Universitätsklinik ist seit mehr als 30 Jahren Referenzlabor der GMALL. Neben den morphologischen Untersuchungen bildet vor allem die Quantifizierung der minimalen Resterkrankung einen wichtigen Schwerpunkt der Referenzdiagnostik.

Autoren: Monika Brüggemann, Heinz-August Horst; II. Medizinischen Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Kiel (aus dem Rundbrief 20, Oktober 2015).

Das Kieler Labor für hämatologische Spezialdiagnostik der II. Medizinischen Universitätsklinik ist seit mehr als 30 Jahren Referenzlabor der Deutschen Multizentrischen Studiengruppe für die akute lymphatische Leukämie (ALL) des Erwachsenen (GMALL). Die morphologische Diagnostik für die GMALL wurde in Kiel von Prof. Löffler aufgebaut und bis Mitte der 90er Jahre für zuletzt mehr als 100 Zentren erbracht [1,2]. Nach der Emeritierung von Professor Löffler wurde die Referenzdiagnostik von seinem Schüler, Professor Horst, weitergeführt. Im Archiv des Kieler Labors für hämatologische Spezialdiagnostik befindet sich durch die Vielzahl der Einsendungen mittlerweile eine der weltweit größten Präparatesammlungen zur ALL.
Die Quantifizierung der minimalen Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) im Rahmen der GMALL wird seit 1998 in Kiel durchgeführt. In der Folgezeit entstand unter der Leitung von Prof. Kneba das Kieler Labor für Hämatologische Spezialdiagnostik, in dem neben der Zytomorphologie auch die Molekulargenetik und Durchflusszytometrie zunehmend an Bedeutung gewannen. In diesen Bereichen war von Beginn an die MRD-Diagnostik lymphatischer Neoplasien ein wesentlicher Schwerpunkt des Labors. Das Kieler Labor wirkte in verschiedenen nationalen und internationalen Konsortien federführend an der Etablierung, Standardisierung und Validierung molekularer und durchflusszytometrischer Methoden zur MRD-Quantifizierung mit. Inzwischen führt das Labor die MRD-Referenzdiagnostik im Rahmen verschiedenster Studien nicht nur für die ALL durch, sondern auch für Patienten mit follikulärem Lymphom, Mantelzell-Lymphom, multiplem Myelom und chronischer lymphatischer Leukämie.
Hiermit war ein kontinuierliches Wachstum des Labors verbunden, sodass bereits 2003 einen Umzug in größere Räumlichkeiten notwendig wurde. Ende 2015 wird das Labor erneut umziehen: Die II. Medizinische Universitätsklinik verlagert ihren kompletten Schwerpunkt aus dem Städtischen Krankenhaus Kiel, in dem die Abteilung seit den 1960er Jahren im Rahmen einer Kooperation mit dem Universitätsklinikum Schleswig-Holstein (UKSH) lokalisiert war, auf den eigentlichen Kieler Campus des Universitätsklinikums. Das bisherige Labor für Hämatologische Spezialdiagnostik wird in diesem Zusammenhang zu einer eigenen Sektion unter der Leitung von Frau Prof. Monika Brüggemann und zieht mit dem gesamten Team in deutlich größere, den Anforderungen an eine moderne Diagnostik entsprechende Räumlichkeiten um. Ab voraussichtlich Dezember 2015 wird die neue Einsendeadresse lauten:

Hämatologielabor Kiel
Sektion für Hämatologische Spezialdiagnostik der Medizinischen Klinik und Poliklinik II, UKSH, Campus Kiel
Langer Segen 8-10
24105 Kiel

Weitere Einzelheiten zum Umzug, der genaue Umzugstermin und die aktualisierten Einsendescheine werden auf der Labor-Homepage abrufbar sein.

Referenzmorphologie im Rahmen der GMALL

Stellenwert der Morphologie

Die Morphologie ist trotz enormer diagnostischer Fortschritte Ausgangspunkt auch der modernen Leukämiediagnostik. So erlaubt die morphologische Beurteilung am konventionell nach Pappenheim gefärbten Blut- oder Knochenmarkausstrich eine schnelle Identifizierung der Blasten und des Blastenanteils. Sie trägt weiterhin wesentlich zur Unterscheidung einer ALL gegenüber einer akuten myeloischen Leukämie (AML) sowie von Lymphom- und Tumorzellinfiltraten bei. In den meisten Fällen ist aufgrund der Morphologie und unter Hinzuziehung der enzymzytochemischen Färbungen für Peroxidase (POX) und Esterase (EST) eine Abgrenzung der ALL gegenüber einer AML möglich. Die Differenzierung der verschiedenen Subtypen der ALL anhand morphologischer Kriterien wurde zwar ebenfalls versucht, sie bleibt aber heute der Durchflusszytometrie vorbehalten. Eine orientierende Immunphänotypisierung wird im Rahmen der Referenzmorphologie ebenfalls durchgeführt. Sie dient insbesondere der Abgrenzung zwischen ALL und AML bei POX negativen Blasten, dem Nachweis des Vorläuferphänotyps der Blasten und zur Beurteilung der Linienzugehörigkeit der Blasten.

Abbildung 1: Empfehlungen zur Terminologie der MRD-basierten Remissions- und Rezidivbeurteilung (Modifiziert nach Brüggemann et al. [7,9]).

Abbildung 2: Prinzip der IG/TR-basierten RQ-PCR. A: Workflow der Etablierung der klonspezifischen PCR. B: Definition des Sensitivität und des quantitativen Messbereichs. C: Quantifizierung eines Verlaufsmaterials anhand der Standardverdünnungsreihe (B und C nach van der Velden et al. [8])

Einsendemodalitäten

Je 6-8 luftgetrocknete, unfixierte, ungefärbte Knochenmark- und Blutausstriche. Die Knochenmarkausstriche sollten möglichst Bröckchen des Knochenmarks enthalten und dünn ausgestrichen sein. Als Antikoagulanz ist eine geringe Menge Citrat möglich, es darf aber kein Heparin zugesetzt werden.

Quantifizierung der minimalen Resterkrankung im Rahmen der GMALL

Die minimale Resterkrankung ist für die ALL des Kindes und des Erwachsenen der wichtigste unabhängige prognostische Faktor [3-6], hat Eingang in die Remissions- und Rezidivbeurteilung gefunden (Abb. 1) [7] und wird auch im Rahmen der GMALL-Studien bzw. des GMALL-Registers zur Therapiestratifizierung eingesetzt. Für die BCR-ABL1-negative ALL stellt im Rahmen der GMALL die quantitative PCR klonaler Immunglobulin (IG)/T-Zell-Rezeptor (TR)-Genumlagerungen die Referenzmethode dar (Abb. 2). Diese Methodik wurde im Rahmen internationaler und nationaler Kooperationen insbesondere innerhalb des EuroMRD-Konsortiums etabliert und standardisiert. Dieses Konsortium stellt einen Zusammenschluss von inzwischen 57 Laboren aus Europa, Nord- und Südamerika, Australien und Asien dar, in dessen Rahmen präzise Richtlinien für die korrekte Interpretation von IG/TR-basierten RQ-PCR-Analysen erarbeitet wurden (Tab. 1) [8]. In jährlichen Ringversuchen und Arbeitstreffen wird die Qualität der Analytik und Interpretation überprüft und weiter optimiert. Der aktuelle 28. Ringversuch des Konsortiums wird derzeit vom Kieler Labor organisiert, in welchem auch die zentrale Auswertung und Zertifikaterstellung des EuroMRD-Qualitätskontrollprogramms erfolgt.

Tabelle 1: Interpretation der molekularen MRD-Resultate.

Qualitatives MRD-Ergebnis

Interpretation

Beispiel

Reproduzierbare PCR-Positivität in allen Replikaten im quantitativen Messbereich des Assays

Quantifizierbarer MRD-Nachweis

1 x 10-3, d.h. Nachweis von Leukämie-DNA in 0,1 % der untersuchten Zellen

PCR-Positivität, Signal jedoch in Replikaten nicht ausreichend reproduzierbar u/o unterhalb des linearen Bereichs des Assays

MRD-Nachweis unterhalb des quantitativen Messbereichs

pos < 1 x 10-4 > 1 x 10-6, d.h. Nachweis von Leukämie-DNA in weniger als 0,01 %, aber mehr als 0,0001 % der Zellen

PCR-Negativität bzw. Nachweis von PCR-Signalen im Bereich der Hintergrundamplifikation

MRD-Negativität im Rahmen der Sensitivität der Methode

< 1 x 10-5, d.h. kein Nachweis von Leukämie-DNA bis zu einem Niveau von 0,001 %. Schließt residuelle Leukämie
< 0,001 % nicht aus.

Neue molekulare Methoden zur molekularen MRD-Quantifizierung

Abbildung 3: Prinzip der amplikonbasierten Hochdurchsatz-Sequenzierung mittels Einschritt-PCR (Modifiziert nach van Dongen et al. [10]).

Die zunehmende Verfügbarkeit von Hochdurchsatzmethoden eröffnet neue Perspektiven für den sensitiven und spezifischen molekularen MRD-Nachweis mittels hochparalleler Amplikon-Sequenzierung von IG/TR-Rearrangements [9-11]. Bioinformatisch wird nach Sequenzierung von Konsensus-IG/TR-PCR-Produkten im diagnostischem Material nach einer klonalen Index-IG/TR-Sequenz als Leukämiemarker gesucht, die im Verlaufsmaterial reidentifiziert wird, um MRD quantifizierbar zu machen (Abb. 3) [10]. Da der Read-Out der Hochdurchsatzsequenzierung (next generation sequencing, NGS) spezifischer als bei der RQ-PCR ist und Millionen Amplikons parallel sequenziert werden können, ist die theoretische Sensitivität der Methodik zumindest gleichwertig, möglicherweise auch besser als die der RQ-PCR. Erste retrospektive Studien zeigen eine gute Vergleichbarkeit der beiden molekularen Methoden [11]. Allerdings sind bisherige Analysen weitgehend monozentrisch, die Standardisierung ist unvollständig, entitätenspezifische Probleme weitgehend unberücksichtigt und die Bioinformatik in den meisten verfügbaren Publikationen nicht offengelegt. Aus diesen Gründen hat sich eine akademische Kooperation, das EuroClonality NGS Konsortium, formiert, das sich eine Standardisierung und Validierung von IG/TR-NGS Assays zur Klonalitäts- und MRD-Diagnostik sowie zur T- und B-Zell-Repertoire-Analyse zum Ziel gemacht hat. Das Kieler Labor hat in dieser Kooperation die Federführung für die Etablierung und Standardisierung der MRD-Assays inne.

Einsendemodalitäten

Derzeitiger Standard der molekularen MRD-Quantifizierung für die Philadelphia-negative ALL ist weiterhin die IG/TR-RQ-PCR. An Material wird hierzu benötigt (siehe auch Tab. 2): Mindestens 5 mL Knochenmarkaspirat in EDTA ggf. zusätzlich 5-10 mL Blut in EDTA.
Der Versand kann an jedem Wochentag bei Raumtemperatur, wenn möglich per Eilpost, erfolgen. Wichtig ist insbesondere die Einsendung initialdiagnostischen Materials vor Therapiebeginn mit hohem Blastenanteil. Sollte z.B. aufgrund einer punctio sicca die Einsendung eines primär-diagnostischen Knochenmarkaspirats nicht möglich sein, ist es in jedem Fall sinnvoll, ggf. nach telefonischer Rücksprache, alternative blastenhaltige Materialien (siehe Tab. 2) einzusenden.

Tabelle 2: Materialversand für MRD-Diagnostik. Versand aller Materialien an allen Wochentagen bei Raumtemperatur möglich. Möglichst Versand per Eilpost (FFPE: fresh frozen paraffin embedded material; KM: Knochenmark).

Erstdiagnose

Knochenmarkaspirat

mind. 5 mL in EDTA

Angabe des Blastenanteils auf Einsendeschein erbeten
Angabe des Subtyps auf Einsendeschein erbeten

Blut

5-10 mL in EDTA

alternativ zu KM-Aspirat bei punctio sicca
bei Ausschwemmung > 10 %
Angabe des Blastenanteils auf Einsendeschein erbeten
Angabe des Subtyps auf Einsendeschein erbeten

Knochenmarktrepanat

ohne Additiva
trocken in Transportgefäß

alternativ zu KM-Aspirat bei punctio sicca
Einsendung unbedingt ohne Formalinzusatz

Ergussmaterial

ohne Additiva

 

Lymphknoten- oder Tumorbiopsat

möglichst unfixiert
bei FFPE-Material möglichst Einsendung des gesamten
Blocks, Restmaterial wird zurückgesandt

z.T. unzureichende DNA-Qualität/Quantität bei Verwendung von FFPE-Material
Analyse eines FFPE-Knochenmarktrepanats wenig erfolgversprechend

MRD-Diagnostik im Verlauf

Knochenmarkaspirat

mind. 5 mL in EDTA

Bei Reizidivverdacht bitte Vermerk auf Einsendeschein

Knochenmarktrepanat

ohne Additiva
trocken in Transportgefäß

alternativ zu KM-Aspirat bei punctio sicca
Einsendung unbedingt ohne Formalinzusatz

Blut

5-10 mL in EDTA

Analyse von Blut bei T-ALL in Erhaltung/Nachbeobachtung statt Knochenmarkaspirat möglich
bei B-Linien-ALL reduzierte Sensitivität

Liquor

nativ

bei Verdacht auf Liquorbefall

Lymphknoten- oder Tumorbiopsat

möglichst unfixiert
bei FFPE-Material möglichst Einsendung des gesamten
Blocks, Restmaterial wird zurückgesandt

bei Verdacht auf extramedulläres Rezidiv
z.T. unzureichende DNA-Qualität/Quantität bei Verwendung von FFPE-Material

Links

Einsendeformulare des Hämatologielabor Kiel (Datum des letzten Seitenbesuchs: 19.11.15)
Internetseite des EuroMRD Konsortiums (Datum des letzten Seitenbesuchs: 19.11.15)

Referenzen und Quellen

  1. Gassmann W, Loffler H, Thiel E, Ludwig WD, Schwartz S, Haferlach T, Maurer J, Rieder H, Fonatsch C, Gökbuget N, Hoelzer D. Morphological and cytochemical findings in 150 cases of T-lineage acute lymphoblastic leukaemia in adults. German Multicentre ALL Study Group (GMALL). Br J Haematol. 1997;97(2):372-82. PMID: 9163604.
  2. Löffler H, Gassmann W. Morphology and cytochemistry of acute lymphoblastic leukaemia. Baillieres Clin Haematol. 1994;7(2):263-72. PMID: 7803901.
  3. Brüggemann M, Raff T, Flohr T, Gökbuget N, Nakao M, Droese J, Luschen S, Pott C, Ritgen M, Scheuring U, Horst HA, Thiel E, Hoelzer D, Bartram CR, Kneba M. Clinical significance of minimal residual disease quantification in adult patients with standard-risk acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2006;107(3):1116-23. PMID: 16195338. doi: 10.1182/blood-2005-07-2708.
  4. Gökbuget N, Kneba M, Raff T, Trautmann H, Bartram CR, Arnold R, Fietkau R, Freund M, Ganser A, Ludwig WD, Maschmeyer G, Rieder H, Schwartz S, Serve H, Thiel E, Brüggemann M, Hoelzer D. Adult patients with acute lymphoblastic leukemia and molecular failure display a poor prognosis and are candidates for stem cell transplantation and targeted therapies. Blood. 2012;120(9):1868-76. PMID: 22442346. doi: 10.1182/blood-2011-09-377713.
  5. Paganin M, Fabbri G, Conter V, Barisone E, Polato K, Cazzaniga G, Giraldi E, Fagioli F, Arico M, Valsecchi MG, Basso G. Postinduction minimal residual disease monitoring by polymerase chain reaction in children with acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 2014;32(31):3553-8. PMID: 25287825. doi: 10.1200/jco.2014.56.0698.
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Erstellt von: Hehn (Informationszentrum) am 19.11.2015, letzte Änderung: 23.11.2015